介紹：口蹄疫（Foot and Mouth Disease ,FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種高度接觸性傳染病，對易感的偶蹄動物具有嚴重的潛在經濟危害。其特征是在口、舌、唇、鼻、蹄、乳房發生水泡，并潰爛形成爛斑。世界衛生組織（OIE）將其列為必須通報疾病。我國2008年修訂的《一、二、三類動物疫病病種明錄》將其列為一類動物疫病。
用途：該試劑盒用于對FMDV進行檢測，有助于對FMDV的實驗室診斷、監測和流行病調查。
原理：本試劑盒采用一步法實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應(One-Step Real Time RT-PCR) ，結合Taqman技術，對特異核酸進行定性或定量檢測。
試劑盒的組成
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試劑名稱 |
數量 |
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FMD反應液 |
550μL×1管 |
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FMD酶 |
40μL×1管 |
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FMD引物探針 |
120μL×1管 |
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無核酸水 |
1000μL×1管 |
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FMD陰性對照 |
50μL×1管 |
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FMD陽性對照 |
50μL×1管 |
保存期及貯藏條件：本產品-20℃避光可保存12個月。
樣品收集，操作和儲存
1. 最好選擇發病早期，無菌采樣并立即送往實驗室進行病毒檢測。
2. 樣品短期可在4℃冷藏保存，較長時間保存應在--20℃或者-70℃，并且避免反復凍融。
檢測步驟
1.核酸提取
樣品進行適當處理后，可采用本公司的核酸提取試劑盒，該試劑盒可用于對樣本中病毒RNA的提取，請按照提取試劑盒說明書進行操作。也可選擇其他合適的商品化產品。
2.擴增試劑的準備
將樣品數+1份陰性對照+1份陽性對照設為N，計算試劑所需量，反應體系配制見下表
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試劑名稱 |
N份用量（20μL 體系） |
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FMD反應液 |
10μL×（N+1） |
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FMD酶 |
0.5μL×（N+1） |
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FMD引物探針 |
1.8μL×（N+1） |
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無核酸水 |
5.7μL×（N+1） |
將各試劑按照表中用量加入無菌離心管中，充分混勻，短暫離心后在PCR反應管中分別加入18μL混合液。
3.加樣
將制備好的樣本，陰性對照，陽性對照各取2μL分別加入對應反應管中，加完后蓋緊PCR反應管蓋，置于PCR儀上。
4.熒光PCR擴增與信號收集
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循環數 |
溫度（℃） |
時間 |
數據收集位點 |
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1 |
45 |
15min |
- |
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1 |
95 |
2min |
- |
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40 |
95 |
15s |
- |
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60 |
1min |
數據收集 |
注：報告基團選FAM,淬滅基團選NONE。
結果成立原則
陽性對照：CT值＜30并有明顯的擴增曲線。
陰性對照：無CT值或者CT值>37，線性為直線或者輕微斜線，無明顯擴增曲線。
以上要求需同時滿足，否則本次實驗無效，需要重新進行。
結果判定
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CT值 |
樣本檢測結果 |
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<30并有明顯的擴增曲線 |
陽性，樣本中檢測出FMDV。 |
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30-37 |
可疑，需重復檢測。若第二次檢測CT值仍為30-37并有明顯擴增曲線則判定為陽性，否則為陰性。 |
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>37并無擴增曲線 |
陰性，樣本中未檢測出FMDV。 |
注意事項
1.反應體系應在特定配液區或者超凈工作臺中配制，整個實驗過程嚴格控制污染。
2.PCR整個試驗分配液區、模板提取區、擴增區。流程順序為配液區→模板提取區→擴增區。嚴禁器材和試劑倒流。
3.使用不含熒光物質的一次性手套，一次性離心管。
4.反復凍融試劑將減低檢測靈敏度，本試劑盒應在5次內用完.
5．-20℃保存的各試劑管使用前應在室溫下完全融化，液體融化后需徹底混勻，2000 rpm離心15 s ，使用后立即放回-20 ℃。
6．在RNA提取過程中，避免RNA酶污染，盡量縮短操作時間。
7．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
8.PCR反應管避免氣泡存在，管蓋需蓋緊。
9.不同批次的試劑盒勿混用。
