介紹:口蹄疫(Foot and Mouth Disease ,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一種高度接觸性傳染病,對易感的偶蹄動物具有嚴重的潛在經濟危害。其特征是在口、舌、唇、鼻、蹄、乳房發生水泡,并潰爛形成爛斑。世界衛生組織(OIE)將其列為必須通報疾病。我國2008年修訂的《一、二、三類動物疫病病種明錄》將其列為一類動物疫病。
用途:該試劑盒用于對FMDV進行檢測,有助于對FMDV的實驗室診斷、監測和流行病調查。
原理:本試劑盒采用一步法實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應(One-Step Real Time RT-PCR) ,結合Taqman技術,對特異核酸進行定性或定量檢測。
試劑盒的組成
試劑名稱 |
數量 |
FMD反應液 |
550μL×1管 |
FMD酶 |
40μL×1管 |
FMD引物探針 |
120μL×1管 |
無核酸水 |
1000μL×1管 |
FMD陰性對照 |
50μL×1管 |
FMD陽性對照 |
50μL×1管 |
保存期及貯藏條件:本產品-20℃避光可保存12個月。
樣品收集,操作和儲存
1. 最好選擇發病早期,無菌采樣并立即送往實驗室進行病毒檢測。
2. 樣品短期可在4℃冷藏保存,較長時間保存應在--20℃或者-70℃,并且避免反復凍融。
檢測步驟
1.核酸提取
樣品進行適當處理后,可采用本公司的核酸提取試劑盒,該試劑盒可用于對樣本中病毒RNA的提取,請按照提取試劑盒說明書進行操作。也可選擇其他合適的商品化產品。
2.擴增試劑的準備
將樣品數+1份陰性對照+1份陽性對照設為N,計算試劑所需量,反應體系配制見下表
試劑名稱 |
N份用量(20μL 體系) |
FMD反應液 |
10μL×(N+1) |
FMD酶 |
0.5μL×(N+1) |
FMD引物探針 |
1.8μL×(N+1) |
無核酸水 |
5.7μL×(N+1) |
將各試劑按照表中用量加入無菌離心管中,充分混勻,短暫離心后在PCR反應管中分別加入18μL混合液。
3.加樣
將制備好的樣本,陰性對照,陽性對照各取2μL分別加入對應反應管中,加完后蓋緊PCR反應管蓋,置于PCR儀上。
4.熒光PCR擴增與信號收集
循環數 |
溫度(℃) |
時間 |
數據收集位點 |
1 |
45 |
15min |
- |
1 |
95 |
2min |
- |
40 |
95 |
15s |
- |
|
60 |
1min |
數據收集 |
注:報告基團選FAM,淬滅基團選NONE。
結果成立原則
陽性對照:CT值<30并有明顯的擴增曲線。
陰性對照:無CT值或者CT值>37,線性為直線或者輕微斜線,無明顯擴增曲線。
以上要求需同時滿足,否則本次實驗無效,需要重新進行。
結果判定
CT值 |
樣本檢測結果 |
<30并有明顯的擴增曲線 |
陽性,樣本中檢測出FMDV。 |
30-37 |
可疑,需重復檢測。若第二次檢測CT值仍為30-37并有明顯擴增曲線則判定為陽性,否則為陰性。 |
>37并無擴增曲線 |
陰性,樣本中未檢測出FMDV。 |
注意事項
1.反應體系應在特定配液區或者超凈工作臺中配制,整個實驗過程嚴格控制污染。
2.PCR整個試驗分配液區、模板提取區、擴增區。流程順序為配液區→模板提取區→擴增區。嚴禁器材和試劑倒流。
3.使用不含熒光物質的一次性手套,一次性離心管。
4.反復凍融試劑將減低檢測靈敏度,本試劑盒應在5次內用完.
5.-20℃保存的各試劑管使用前應在室溫下完全融化,液體融化后需徹底混勻,2000 rpm離心15 s ,使用后立即放回-20 ℃。
6.在RNA提取過程中,避免RNA酶污染,盡量縮短操作時間。
7.注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的成分不要混用。
8.PCR反應管避免氣泡存在,管蓋需蓋緊。
9.不同批次的試劑盒勿混用。