非洲豬瘟（Africanswinefever，ASF）由非洲豬瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）引起的一種豬的急性、熱性、高度傳染性疾病。臨床表現為高熱、全身出血、脾臟異常 腫大、呼吸障礙和神經癥狀，死亡率可達100%。世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須通報的疫病。
2、用途：
該試劑盒用于ASFV的核酸檢測，有助于對ASF的實驗室診斷、監測和流行病調查。
3、原理：
本試劑盒采用Taqman探針實時熒光聚合酶鏈式反應(RealtimePCR)，對ASFV核酸進行定性或半定量檢測。
4、組分：
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試劑名稱 |
數量 |
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樣本處理液 |
5ml×1管 |
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ASF PCR反應液 |
1100µl×1管 |
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ASF陰性對照 |
100µl×1管 |
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ASF陽性對照 |
100µl×1管 |
樣本處理液2-8℃避光保存12個月；其它試劑-20℃避光保存12個月。
7、樣品收集和儲存：
1.推薦選擇抗凝血、血清、組織等樣本，無菌采樣并立即送往實驗室進行檢測。
2.樣品短期可在4℃冷藏保存，較長時間保存應在-20℃或者-70℃，并且避免反復凍融。
8、操作步驟：
1.樣本處理
（1）血液樣本：
血液樣品無需處理。
（2）組織樣本：
分別從豬肉組織、淋巴結、脾臟不同位置取樣，用手術剪剪碎混勻后取 0.1g 于研磨器中研磨，加入 1.5ml 生理鹽水繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5ml 無菌離心管，4000 r/min 離心 2 分鐘，取上清 備用。
2.樣本核酸提取
根據待檢樣品數量，準備無菌 1.5ml 離心管，每管加入 90μl 樣本處理液。
每管分別加入已處理的待檢樣品 10μl，充分混勻，室溫放置 2 分鐘。
4000 r/min 離心 1 分鐘，上清即為模板 DNA。
3.加樣
在配套 PCR 管中加入20μlPCR反應液，將制備好的模板 DNA，陰性對照，陽性對照各取 5µl分別加入對應反應管中，加完后蓋緊PCR反應管蓋，置于PCR儀上。
4.熒光PCR擴增與信號收集
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循環數 |
溫度（℃） |
時間 |
數據收集位點 |
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1 |
94 |
2min |
- |
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40 |
94 |
5s |
- |
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60 |
15s |
數據收集 |
注：報告基團選FAM,淬滅基團選NONE。
9、結果成立條件：
陽性對照：CT值＜32并有明顯的擴增曲線。
陰性對照：無CT值或者CT值>38，線性為直線或者輕微斜線，無明顯擴增曲線。
以上要求需同時滿足，否則本次實驗無效，需要重新進行。
10、結果判定：
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CT值 |
樣本檢測結果 |
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≤36并有明顯的擴增曲線 |
陽性，樣本中檢測出ASFV核酸。 |
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>36有明顯的擴增曲線 |
可疑，需重復檢測。若第二次檢測CT值仍>36，并有明顯擴增曲線則判定為陽性，否則為陰性。 |
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無CT值，或者CT值>36并無明顯的擴增曲線 |
陰性，樣本中未檢測出ASFV核酸。 |
注意事項：
1.所有實驗過程應遵守農業農村部關于非洲豬瘟病毒檢測相關的規定。
2.反應體系應在特定配液區或者超凈工作臺中配制，整個實驗過程嚴格控制污染。
3.PCR整個試驗分配液區、模板提取區、擴增區。流程順序為配液區→模板提取區→擴增區。嚴禁器材和試劑倒流。
4.反復凍融試劑將減低檢測靈敏度，本試劑盒應在5次內用完.
5.-20℃保存的各試劑管使用前應在室溫下完全融化，液體融化后需徹底混勻，2000rpm離心15s，使用后立即放回-20℃。
6.在DNA提取過程中，避免核酸酶污染，盡量縮短操作時間。
7.注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
8.PCR反應管避免氣泡存在，管蓋需蓋緊。
9.不同批次的試劑盒勿混用。
