頸靜脈插管是一種重要的動物實驗方法, 已被廣泛應用于動物實驗長期靜脈給藥、采血等研究, 如靜脈壓測量^[1]、藥物代謝動力學^[2]、葡萄糖鉗夾實驗^[3]等動物實驗。小鼠具有體積小、價格較低、操作方便快捷等優勢, 是最為常見的實驗動物。目前國內在家兔、大鼠等實驗動物中的頸靜脈插管方法已有較多研究^[4], 而小鼠體積較小, 頸靜脈極細, 導致插管難度大, 關于小鼠頸靜脈插管方法的報道較少。因此, 改進并推廣小鼠頸靜脈插管方法將為科研人員帶來極大的便利。本研究詳述了小鼠頸外靜脈插管的方法、操作步驟及注意事項, 為小鼠動物實驗提供一種方便有效的靜脈給藥、采血途徑。

8周齡C57BL/6小鼠30只, 雌雄各半, 體重20~25g, 購于南京醫科大學實驗動物中心, 按照標準操作規程飼養于SPF級動物房中。所有動物實驗經南京醫科大學實驗動物倫理委員會批準。硅膠管 (內徑0.51mm, 外徑0.91mm;內徑0.31mm, 外徑0.64mm) , 標準眼科手術器械, 維納斯剪, 精細鑷, 顯微解剖鏡, 棉簽, 結扎線, 縫合線, 肝素帽, 5%水合氯醛, 150U/ml肝素鈉注射液, 75%乙醇, 碘伏消毒液。

內徑0.31mm、外徑0.64mm的硅膠管剪下長約6cm的一段, 一端作為插管口, 并將管口剪出約呈45度的楔形面。角度不可過小, 防止管口過于尖銳導致插管過程中刺破血管壁。內徑0.51mm、外徑0.91mm的硅膠管剪下長約1mm的一小段作為嵌套管。將嵌套管套在內徑0.31mm、外徑0.64mm的硅膠管楔形口1cm處 (圖1) , 置于75%乙醇中消毒備用。術前用1ml的注射器吸取150U/ml肝素鈉注射液0.5ml, 將針頭插入導管緩慢推動活塞, 使導管充滿肝素鈉注射液, 將導管末端用肝素帽封閉。

C57BL/6小鼠腹腔注射0.1ml/10g體重的5%水合氯醛溶液麻醉, 電動剃毛器剃去小鼠右側頸部皮膚表面及背部耳后皮膚表面的毛發, 使用75%乙醇及碘伏消毒液常規備皮消毒。以仰臥位將小鼠四肢用膠布固定于小鼠手術臺上。所有手術器械置于75%乙醇中消毒, 將小鼠右側頸部調整至顯微解剖鏡視野中央并放大合適的倍數。在小鼠鎖骨上方, 使用眼科剪在頸前正中線右側1cm處作一長約1cm的縱切口 (見封二圖2A) 。使用眼科鑷小心分離脂肪并游離頸外靜脈, 長度約為1cm, 自頸橫靜脈與肩胛上靜脈匯入點之間下方穿雙股線 (見封二圖2B) 。結扎遠心端, 近心端留一活結用于固定導管。用維納斯剪緊鄰遠心端靜脈結扎點開V形口, 長度不得大于頸靜脈直徑。在鏡下將導管自開口插入頸外靜脈, 深度約1cm, 直至嵌套管。確定導管進入靜脈后, 將遠心端結扎線在嵌套管后方再次結扎固定, 近心端所留活結拉緊固定, 以防導管滑出 (見封二圖2C) 。插管完畢后, 翻轉小鼠, 于頸背部正中備皮處作長約0.5cm的縱切口, 使用眼科鑷自頸前切口與背部切口之間打通皮下隧道, 將靜脈管游離端經皮下隧道從背部開口穿出, 剪短導管至1cm, 并重新用肝素帽封閉 (見封二圖2D) ?？p合手術切口, 再次備皮消毒。將小鼠側臥放回籠具中單籠飼養。

小鼠術后應單籠飼養, 防止互相撕咬導管。術后肌肉注射青霉素20 000U/kg抗感染。監測體重、飲食、飲水等指標, 5d后即可開展后續實驗。硅膠管作為外源物質可誘發生理性凝血, 小鼠頸靜脈較細, 導管堵塞是較為常見的插管模型失敗原因。術后恢復期每天應檢查導管通暢程度, 具體操作步驟如下:取下靜脈導管末端肝素帽, 連接裝有150U/ml肝素鈉注射液的注射器, 緩慢拉動活塞, 回血表明導管通暢。若拉動活塞具有明顯阻力, 可緩慢推動活塞, 清除管口處的血凝塊。給藥或采血時, 應先連接注射器吸出導管中保留的肝素鈉, 再更換注射器進行操作, 最后再注入肝素鈉0.1ml維持導管通暢。

正常小鼠頸外靜脈位置表淺, 走行于頸部淺筋膜中, 是頸部靜脈插管的常用血管。上頜靜脈與顳淺靜脈在咬肌下緣匯合成下頜后靜脈, 下行過程中接納耳后靜脈回流至頸外靜脈。頸外靜脈沿胸乳突肌表面下行, 下行過程中收納面前靜脈回流, 在與胸乳突肌下緣交界處依次收納頸橫靜脈和肩胛上靜脈回流, 于胸乳突肌下端深面收納頸前靜脈。在胸鎖關節后方, 頸外靜脈與鎖骨下靜脈匯合成頭臂靜脈。插管位置應選擇頸橫靜脈與肩胛上靜脈匯入點之間。 (圖3)

本研究30只小鼠中有1只因插管時間較長, 出血過多死亡, 其余均存活, 存活率為96.7%。術后7、14、21、28d檢查導管通暢率分別為96.6%、93.1%、86.2%、86.2%。

家兔、大鼠等體型較大的嚙齒類實驗動物頸靜脈插管模型在國內已多有報道。湯海濤等^[5]利用玻璃分針阻斷遠端頸外靜脈回流, 進行血管壁穿刺插管。李學林等^[6]報道了改進的頸靜脈導管固定方法。由于大鼠體型大, 頸靜脈較粗, 可以應用引導管等方式輔助插管, 降低插管難度^[7]。但小鼠體型較小, 頸外靜脈細, 插管難度大, 目前國內關于小鼠頸靜脈插管的報道較為罕見, 僅有劉建雷等^[8]、付真真^[9]在小鼠葡萄糖鉗夾術中報道了利用小鼠頸靜脈插管靜脈持續灌注葡萄糖, 從而測定胰島素敏感性。包括葡萄糖鉗夾實驗在內, 小鼠頸靜脈插管方法在國外也有報道^[10]。本研究在已有報道的基礎上詳述了小鼠頸靜脈插管步驟, 并對小鼠頸外靜脈插管方法做出一定的改進, 將插管位置精確至肩胛上靜脈與頸橫靜脈匯入點之間, 提供了詳細的解剖示意圖, 降低了插管難度, 提高插管成功率。

本研究發現, 小鼠右側頸外靜脈注入右頭臂靜脈, 與上腔靜脈約呈一直線, 導管容易進入。相比于右側, 左側頸外靜脈與上腔靜脈形成的角度過大, 不利于導管進入, 因此應選擇右側頸外靜脈插管。頸外靜脈游離過程中應盡量減少出血, 以防影響視野。此外, 在肥胖或年齡較大的小鼠中, 還應注意分離與血管粘連的脂肪結締組織。結扎血管后, 由于靜脈回流被阻斷, 游離的頸外靜脈不如先前清晰易辨認。因此, 若脂肪分離不徹底, 將會對插管帶來一定的干擾作用。

插管位置選擇頸橫靜脈與肩胛上靜脈匯入點之間最佳。若選擇在最佳位置遠心端, 頸外靜脈不如最佳位置粗大, 給插管帶來了一定的難度。若選擇在最佳位置近心端, 頸外靜脈游離插管長度不夠, 不便于操作。結扎固定靜脈導管時, 應注意以嵌套管長度作為標志, 以免插入過深, 損傷心臟。小鼠背部的游離管不宜長于1cm, 防止小鼠清醒后咬斷。由于小鼠體型小、靜脈細, 給操作帶來了一定的難度, 操作者應勤加練習, 提高插管成功率。此外, 同樣由于小鼠靜脈較細, 導管堵塞率較高, 是小鼠頸靜脈插管模型失敗的另一重要原因。按照本研究提供的方法, 不給藥時每天以肝素鈉沖洗維護導管, 28d后通暢率仍達到85%以上, 能夠滿足長期靜脈給藥需求。